Disciplina - detalhe

CEN5739 - Métodos Experimentais em Biologia Molecular de Plantas


Carga Horária

Teórica
por semana
Prática
por semana
Créditos
Duração
Total
4
5
15
15 semanas
225 horas

Docentes responsáveis
Antonio Vargas de Oliveira Figueira

Objetivo
Apresentar técnicas básicas de DNA recombinante, incluindo a extração, quantificação e análise de ácidos nucleicos (DNA e RNA), e manipulação genética de bactérias (Escherichia coli e Agrobacterium tumefaciens) e plantas, e análise da expressão gênica. É abordada a utilização dessas técnicas para responder diversas perguntas biológicas relevantes, uso em estudos básicos de Biologia, Fisiologia e Bioquímica de Plantas, e potenciais aplicações na agricultura. Trata-se de uma disciplina introdutória as metodologias, essencialmente com exposição dos alunos a práticas, com demonstrações e pequenos experimentos, contendo breve introduções teóricas sobre as práticas e experimentos a serem realizados, assim como discussões sobre o potencial de utilização e aplicação em problemas agroambientais.

Conteúdo
Teórico:
a. Manipulações microbiológicas de Escherichia coli e Agrobacterium tumefaciens;
b. Isolamento, purificação, quantificação de ácidos nucléicos (DNA e RNA);
c. Métodos de manipulação de ácidos nucléicos (digestão, ligação, transformação, hibridização e clonagem);
d. Fundamentos de PCR;
d. Análise da expressão gênica (RT-qPCR);
f. Análise de sequências e desenho de primers;
g. Transformação de plantas por A. tumefaciens e biolística;
h. Expressão heteróloga de genes em E. coli.
Laboratório
1. Manipulações em Escherichia coli e Agrobacterium tumefaciens;
• Técnicas de manipulação microbiológica; meios de cultura e seleção; curva de crescimento, manutenção, concentração e diluição; Isolamento de plasmídeo, digestão por enzima de restrição, isolamento de gene e ligação; Transformação de Escherichia coli e Agrobacterium tumefaciens por quimio- e eletroporação; Conjugação de bactérias (E. coli e A. tumefaciens);
2. Isolamento, purificação e quantificação de ácidos nucleicos de tecidos vegetais (DNA e RNA);
3. PCR;
4. Análise de RNA;
• Extração, quantificação e análise de RNA; Síntese de cDNA; Amplificação quantitativa de transcritos reversos (RT-qPCR);
5. Enzimas de manipulação de ácidos nucleicos;
• Enzimas de restrição; DNA ligase e DNA polimerase; Fosfatases, exonucleases e nucleases;
6. Transformação de plantas por Agrobacterium tumefaciens;
7. Expressão heteróloga de genes em E.coli;
• gel de acrilamida para análise de proteínas – SDS-PAGE e nativo; atividade enzimática;
8. Análise de sequencias e desenho de primers;
• apresentação de banco de dados de sequências; busca de sequências; alinhamento de sequências; desenho e análise de iniciadores.

Bibliografia
1. BRASILEIRO, A.C.M.; CARNEIRO, V. T. de C. Manual de transformação de genética de plantas. 2a. ed. Brasília, DF: Embrapa, 2015.
2. BROWN, T.A. Genomes 4. 4th ed. Garland Science, Taylor and Francis Group, New York, NY, EUA, 2019.
3. CHRISPEELS M.J.; SADAVA D.E. Plants, Genes, and Biotechnology. Sudbury: Jones and Bartlett Publishers. 2003.
4. MENCK, C.F.M.; VAN SLUYS, M.-A. Genética Molecular Básica. Ed. Guanabara Koogan. Rio de Janeiro, RJ. Brasil. 2017.
5. SAMBROOK, J.; RUSSEL, D.W. The condensed protocols: from Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Cold Spring
Harbor Laboratory Pres, Cold Spring Harbor, NY, EUA. 2006.
6. WALKER, J.M.; RAPLEY, R. Molecular Biomethods Handbook. Human Press, Totowa, NJ, EUA, 2008.